Diagnosticare gena preimplantare

Combinația sa cu un test pentru aneuploidiei poate imbunatati rezultatele FIV. ADN-ul pentru genodiagnostic preimplantare preparat din corp polar, etapa biopsie de strivire fie blastocistului zigot biopsie.

Analiza ADN-ului este realizată pe corpul polar al procedurii stadiul ovocitului II. Principalul dezavantaj al acestei metode constă în faptul că, pentru a confirma genotipul embrionului, este nevoie de diagnostic prenatal. Recombinarea cromozomilor în diviziunea meiotice prima poate cauza diagnostic greșit. In cele mai multe centre de a efectua biopsie de embrioni, care poate detecta boala, mostenita de la parinti. Materialul biopsiei obținut, de obicei, în etapa de zdrobire zigotului (pasul opt celule) selectarea celulelor 1-2. Din cauza dificultăților legate de diagnosticul pe o astfel de material limitat (a se vedea. De mai jos), blastocist în mod ideal mai bine biopsie, deoarece conține până la 300 de celule. În plus, biopsia poate fi luat celulele trofoblastice, deoarece acestea sunt mai ușor accesibile și nu interferează cu dezvoltarea adecvată a embrionului. Cu toate acestea, biopsie blastocist se realizează nu în toate centrele din cauza complexității cultivării sale celulelor în cultură și a scăzut supraviețuirea blastocysts după crioconservare. Cu toate acestea, utilizarea acestor metode, este posibil de a realiza sarcina, si-a lungul timpului, cu experienta, eficacitatea lor este probabil să crească.

Materialul obtinut la biopsie, analizat prin una din cele două metode: PCR sau hibridizare fluorescenta in situ. Laboratoarele care efectuează astfel de teste trebuie să aibă un certificat în raportul său indică metoda care a fost utilizată, precum și rezultatul de decodare a rezultatelor. Cu toate acestea, un specialist de fertilitate este extrem de important să se înțeleagă metodele moleculare și genetice ale genodiagnostic preimplantare, cererile lor și dezavantajele lor inerente.

PCR

PCR este cel mai potrivit pentru diagnosticul zabolevanij monogenice folosi pentru a determina sexul embrionului este de asemenea, deși acest lucru se va acum din ce folosind hibridizare fluorescenta in situ. Pentru a identifica prin PCR o mutație într-o anumită genă, este necesar înainte de FIV să știe ce să caute mutații, și pre-selectați condițiile de reacție. În fiecare reacție trebuie să fie incluse în controalele pozitive și negative corespunzătoare, în caz contrar rezultatele nu pot fi de încredere. Trebuie amintit că, în timpul reacției poate fi o serie de provocări, printre care:

1. absența produsului PCR;
2. contaminarea probei;
3. Pierderea de alele.

În plus, în mai multe centre, în cazul în care aveți de gând să se aplice pentru PCR de diagnostic pre-implantare, au recurs la injectarea intracitoplasmatică de spermă, pentru a evita posibilele erori de diagnostic cauzate de introducerea unui înveliș transparent de sperma suplimentare.

Deoarece numărul genodiagnostics preimplantare de ADN matriță pentru PCR nu este suficient - de obicei, câteva picograme, în timp ce sunt utilizate în mod normal în PCR sută de nanograme, este necesar să se mărească numărul de cicluri de amplificare. Dacă ADN-ul PCR luat dintr-o singură celulă (sau celule multiple) necesită adesea 35-60 cicluri, în timp ce standardul PCR (atunci când valoarea eșantionului nu este un factor limitativ) - aproximativ 30. O altă soluție este PCR cu primeri nested (sau un primer cuibărit): două reacții succesive pentru amplificarea unor cantități mici de matriță țintă. In ultimii ani, am folosit primeri cu etichete fluorescente pentru analiza unor cantități foarte mici de ADN, îmbunătățind astfel sensibilitatea PCR este de aproximativ 1000 de ori și, astfel, reduce numărul de cicluri de amplificare.

Pentru a elimina contaminarea probei trebuie să fie pregătit foarte atent și amestecul de reacție dețin plus reaktsiyu-, în reacție includ un control negativ (amestec de reacție care conține toate ingredientele, cu excepția ADN-ului). Dacă se detectează produsul PCR de control negativ, posibilitatea contaminării eșantionului de ADN străin - în acest caz, rezultatele PCR în restul probelor nu pot fi de încredere. Deoarece utilizarea primerilor cu un număr de cicluri de marcare fluorescentă PCR probabilitate mai mică de contaminare a probei de mai jos.

alela pierdere înseamnă că amplificat practic una dintre alelele, în timp ce al doilea amplificat foarte slab sau nu amplificat deloc. Evident, aceasta are cea mai mare valoare în identificarea bolii cu transmitere autozomal dominantă. Dacă „pierdut“ alelă dominantă conține o mutație, eroarea în analiza poate conduce la transferul embrionului în cavitatea uterină conținând gena mutant. Puteți amplifica simultan fragment de ADN strâns distanțate diferit având un grad înalt de polimorfism (multiple PCR) Pentru a ocoli această problemă. Mai mult decât atât, după cum sa menționat deja, puteți îmbunătăți sensibilitatea PCR folosind primeri cu o etichetă fluorescentă.

Asociația preimplantare genodiagnostics Grupului European de Reproducere Umana si Embriologie (ESHRE) a evaluat acuratețea diagnostică a PCR și hibridizare fluorescenta in situ. Potrivit ani 1999-2001., In 81 preimplantare caz genodiagnostic, după PCR a fost realizată folosind prenatal sau diagnostika- postnatale, în care eroarea în diagnosticul bolilor este moștenită în legile mendeliene detectate în 5 cazuri (6,2%). diagnosticare repetate pentru a confirma rezultatele a fost efectuat doar jumătate din diagnosticul de preimplantare. De asemenea, este necesar să se ia în considerare cazurile în care era imposibil să efectueze o biopsie sau imposibil de diagnosticat.

Fluorescența hibridizare in situ

Această metodă constă în aceea că sonda (ADN mono-catenar) care poartă o etichetă fluorescentă, hibridizează la ADN din placa metafază denaturate, celule individuale sau țesuturi. Metoda poate fi utilizată în diagnosticarea genei preimplantare pentru:

1. embrion sexare pentru bolile legate de X, nu există posibilitatea de a efectua un PCR;
2. detectarea translocații cromozomiale;
3. detecta modificări ale numărului de cromozomi;
4. detecta alte anomalii cromozomiale, cum ar fi aneuploidie.

În studiul aneuploidiei privind posibilele dificultăți tehnice legate de definirea numărului de cromozomi. În cazul în care pentru a analiza celulele interfazice individuale sunt luate, este dificil să se determine cu exactitate numărul de semnale (cu alte cuvinte, cromozomi) atunci când issleduesh o singură celulă. Dacă vedeți doar un singur semnal, aceasta poate însemna monosomy pe acest cromozom, dar, de asemenea, se suprapun semnale sau că hibridizarea sondei cu unul dintre cromozomi nu a reușit. În mod similar, prezența a trei sau mai multe semnale pot însemna trisomia, dar poate fi din cauza unor probleme tehnice: semnal de vedere dublă sau fluorescență anormală. Pentru a extinde capacitatea de diagnosticare poate aplica simultan cel puțin trei sonde: pe cromozomul X, cromozom Y si autozomi unul din exemplul 18-lea cromozom. În acest caz, laboratorul ar trebui să monitorizeze întotdeauna să fie strict calitatea de hibridizare la o precizie de diagnostic a fost la fel de mare posibil, deoarece este cunoscut faptul că în studiul de 100 de celule diploide normale 100 de perechi de semnale pentru fiecare cromozom nu vor putea primi. capabilități de diagnosticare se va extinde, în cazul în care va fi posibil să se analizeze un număr mai mare de celule.

În această metodă de detectare a translocații frecvent utilizate sonde flanchează translocarea sau poziția de prindere. Deoarece sonde cromozomiale metafază imediat după preparare pentru corpurile polare FIV ovocitului contin condensați pot fi folosite pentru „pictura“ cromozomi in combinatie cu sonde centromerică la porțiuni (repetitive alfa prin satelit) și anumiți loci. Din păcate, celulele de la etapa de scindare a zigotului sau la stadiul de blastocist, astfel de sonde sunt nepotrivite deoarece cromozomi nu poate fi în metafaza și insuficient topite. O metodă în care sonde sunt folosite pentru subtelomerice regiuni ale cromozomului specific translocare cromozomială apare între ele, și o porțiune de sondă centromeric, proximal în legătură cu locul de translocare. Astfel de sonde pot detecta în interfază celule decompensata translocare, dar nu se poate distinge între un cromozom normal prin translocații cromozomiale cu compensata.

Conform raportului Asociației pentru genodiagnostics preimplantare Grupul European de Reproducere Umana si Embriologie, hibridizare fluorescenta in situ a dat rezultate eronate în 8 cazuri din 145, când, după diagnosticul de preimplantare efectuat prenatal sau postnatal (5,5%). Printre Misdiagnosis - două cazuri de trisomie, unul trisomia mozaic, un monosomy și una compensate și translocatie decompensată. In plus, studiul asupra aneuploidiei a fost trisomia nedetectate a cromozomului 21. Așa cum este cazul cu confirmarea PCR a fluorescenței în rezultatele de hibridizare in situ a fost realizată în mai puțin de jumătate din femeile care au suferit diagnostice ale genei preimplantare.

Rolul fluorescenta in hibridizare in situ în determinarea translocații astăzi nu este clar, deoarece 50-70% din cazuri, în care părinții sunt transportatori compensate translocații reciproce, când embrionii sunt decompensat translocare studiu. Aceste date publicate cu privire la incidența sarcinii de succes, după studii variază considerabil, dar în conformitate cu datele din cele trei centre majore ale frecvenței de sarcină în ceea ce privește administrarea unui ou este de 29%. Unii autori au raportat că diagnosticare gena preimplantară reduce riscul aborta- spontane, dar nu este clar dacă acesta crește rata de finalizarea cu succes a sarcinii, comparativ cu concepția naturală, deoarece mai mult de jumatate din embrionii vor avea anomalii și, astfel, mai probabil, în orice caz, nu va supraviețui. În ciuda faptului că gena de diagnosticare preimplantare pentru a testa pentru aneuploidia a fost utilizat în mod repetat cu FIV, nici unul dintre cele publicate studii prospective randomizate au aratat nici o creștere semnificativă a numărului de rezultatul de succes al sarcinii. FIV cu diagnosticul de preimplantare - o procedură invazivă și costisitoare, de aceea este important să se delimiteze cu precizie rolul practic al acestei metode.

Asociația pentru genodiagnostics preimplantare Grupului European de Reproducere Umana si Embriologie

Desenați concluziile potrivite din rezultatele genodiagnostic preimplantare efectuate prin PCR și hibridizare fluorescenta in situ, în practică, nu este încă întotdeauna posibil. Conform raportului Asociației pentru genodiagnostics preimplantare Grupul european pentru Reproducere Umana si Embriologie pentru 1999- 2001 bienal., Realizat în 1197 de cicluri ECO, așa cum arată rezultatele prenatale ulterioare sau diagnostic postnatal, diagnosticare gena preimplantare folosind PCR a dat un rezultat eronat în 5%, și cu utilizarea de fluorescență hibridizare in situ - 6% din cazuri. De asemenea, trebuie apreciat că diagnosticul ulterior efectuat mai puțin de jumătate din timp, astfel încât numărul de diagnostice greșite poate fi prea mică. Cu toate acestea, aceste date nu înseamnă că, în 94% din cazuri a fost făcut un diagnostic corect. Potrivit Asociației, rata globală a sarcinii după recoltarea ouălor a fost de 17%, o biopsie a avut succes in 97% din cazuri, diagnosticul și capabil să dețină doar 86% din cazuri. În total, acest lucru înseamnă că un diagnostic corect al diagnosticului de preimplantare a fost realizat aproximativ 85% din cazuri. Cei care sunt pe cale să se supună diagnostice genetice preimplantare, ar trebui să fie avertizați că în 15% din cazuri, diagnosticul corect nu se poate pune.