Metode non-izotopice ale immunoassay hormonilor

Aceasta a fost prima metodă de determinare cantitativă exactă a hormonilor, a fost utilizat pe scară largă și a jucat un rol imens în diagnosticul de laborator de tulburări endocrine. Ea se bazează pe principii moderne, formate de imunotestare RIA hormoni. Cu toate acestea, în ultimii douăzeci de ani, RIA a fost aproape complet eliminate din practica clinică a metodelor non-izotopice ale immunoassay - ELISA și analiza immunohemilyuminestsentnym. Baza acestor metode, precum și în RIA bazat pe interacțiunea dintre antigeni și anticorpi, dar sunt utilizate ca izotopii etichete non-radioactive, și enzimele care catalizează o reacție pentru a forma un produs colorat, sau substanță luminiscentă. În primul caz, în etapa finală a analiza densitatea optică a amestecului de reacție în al doilea - numărul de fotoni emise de o substanță luminiscentă.

Video: laborator regional și imunochimice centru de diagnostic metode de cercetare IHMI

legat testul immunosorbent

Pentru determinarea cantitativă a hormonilor cel mai frecvent utilizate în fază solidă ELISA cu doi anticorpi. Acesta este realizat în plăci de plastic cu mai multe godeuri. In partea de jos a sondelor sorbită anticorpi monoclonali specifici pentru un anumit hormon de determinant antigenic. Alveolele au fost probe de seruri cu concentrații necunoscute ale hormonilor sau standard, probe cu concentrații cunoscute ale hormonului. Placa a fost incubată timp de 30-120 min-de data aceasta, moleculele hormonului reușesc să se conecteze cu anticorpi adsorbiți pe plastic. După incubare, godeurile au fost spălate cu tampon pentru a îndepărta hormonul nelegat și alte componente de ser. Apoi, godeurile de luare anticorpi policlonali la hormonul conjugat cu peroxidaza (așa-numitul conjugat), iar placa a fost incubată timp de 15-30 min. În care molecula de conjugat se leagă la moleculele de hormon. Godeurile au fost spălate din nou pentru a îndepărta conjugatul nelegat și se adaugă la soluția lor conținând substrat de peroxidază incolor. Peroxidaza transformă substratul într-un produs colorat. Intensitatea soluțiilor de colorare în godeurile (acesta a fost măsurat într-un fotometru) este direct proporțională cu cantitatea de conjugat în bine și este - concentrația de hormoni. concentrația de hormon din probele de ser se calculează dintr-o curbă de calibrare preparată din măsurătorile concentrațiilor de hormoni de probe standard.

Trebuie subliniat faptul că această metodă ELISA, spre deosebire de metodele RIA descrise mai sus, este necompetitiv. Faptul că, în amestecul de reacție absent antigenul marcat și nivelul de legare a anticorpilor policlonali (conjugate) cu antigenul adsorbit pe anticorpii monoclonali depinde de concentrația de antigen în probă. Metodele necompetitive sunt utilizate și atunci când analiza immunohemilyuminestsentnom.

analiza Immunohemilyuminestsentny

Există mai multe opțiuni immunohemilyuminestsentnogo analiză. Vom descrie un exemplu de realizare, care este utilizat pentru a măsura nivelurile de gonadotropine în autoanalizator moderne. In acest exemplu de realizare, hormonul este utilizat pentru legarea microparticule paramagnetice acoperite cu anticorp monoclonal înalt specific pentru un hormon dat. Microparticulele sunt suspendate într-o soluție tampon și se adaugă la o suspensie de probe de ser sau probe standard. După o incubare scurtă (10- 20 min) microparticule cu hormon de legat este precipitat într-un câmp magnetic și se spală de mai multe ori. Apoi microparticulele sunt resuspendate în tampon și se adaugă la o suspensie de anticorpi policlonali la hormonul conjugat cu fosfatază alcalină. După spălare de conjugat nelegat a fost adăugat la o suspensie de microparticule de fosfat dioksetina. Sub acțiunea fosfat fosfatazei alcaline dioksetina formate dioksetin care emit raze de luminiscență. Intensitatea luminiscență, care este măsurată de un fotomultiplicator, este direct proporțională cu concentrația hormonului în eșantion.

Studii de laborator: Video

Metode pentru detectarea autoanticorpilor

Tulburări ale aparatului genital pot fi cauzate direct sau indirect de patologii autoimune. De exemplu, infertilitatea masculină poate fi cauzată de un răspuns autoimun împotriva spermei, iar in patogeneza infertilitatii feminine poate juca rolul unei boli autoimune a tiroidei sau a glandelor suprarenale. Markerii patologii autoimune sunt autoanticorpi. Pentru detectarea autoanticorpilor serici (de exemplu, anticorpi antifosfolipidici, anticorpi la yodidperoksidaze sau 21-hidroxilazei) utilizat ELISA metodă de analiză immunohemilyuminestsentny și imunofluorescență indirectă. În acest ultim caz, ca substrat antigenic folosind secțiuni de țesut criostat, împotriva cărora reacția autoimună este îndreptată. Pentru detectarea anticorpilor spermatozoizilor in sperma si metoda microagglutination mucus cervical folosite cu particule de latex acoperite cu anticorpi la IgA sau IgG.

alte metode

Pentru unii hormoni, cum ar fi catecolamine si serotonina, nu este ușor să se stabilească metode fiabile de teste imunologice. Faptul că aceste materiale au o greutate moleculară foarte mică și împotriva lor este dificilă obținerea de anticorpi primari foarte specifici, monoclonali chiar. Dificultăți similare apar în dezvoltarea metodelor de testare imunochimice a hormonilor steroizi și derivați ai acestora (datorită probabilității ridicate de reacție încrucișată cu diferiți steroizi anticorpi primari având o mare similaritate antigenic). Prin urmare, pentru analiza cantitativă exactă a acestor agenți în ultimii ani au angajat din ce în ce cromatografia lichidă de înaltă performanță, urmată de spectrometrie de masă.

De multe ori, tulburări endocrine, inclusiv tulburări de reproducere, nu sunt cauzate de modificări patologice ale nivelului de gonadotropină sex hormoni și mutațiile lor receptori. Pentru a evalua funcția de receptor utilizat anterior teste biologice in vitro: pacientul a luat o biopsie de tesut care este tinta de hormon, biopsii au fost plasate în mediu de cultură a fost adăugat la mediu și evaluat răspunsul țesutului hormonului la acest hormon. mutațiile receptorilor Astăzi detectate prin determinarea secvenței de ADN de nucleotide în genele corespunzătoare. ADN-ul pentru astfel de teste sunt de obicei preparate din limfocite pacient.